“抗癌藥”大突破！這種首創小分子藥物，竟能逆轉癌癥驅動機制，促進20種癌癥的免疫治療

  一直以來，耐藥性都是腫瘤研究的熱點和難點。

  耐藥性是如何產生的呢？作用于RNA1（ADAR1）的腺苷脫氨酶，通過在應激反應期間防止逆轉錄病毒整合以及逆轉錄轉座，來保持基因組完整性。然而，炎癥微環境誘導的ADAR1p110到p150剪接亞型轉換，驅動了20種惡性腫瘤中癌癥干細胞（CSC）的生成，導致耐藥性的產生。

  近日，來自美國加州大學的研究者在《Cell Stem Cell》發表了題為“Reversal of malignant ADAR1 splice isoform switching with Rebecsinib”的研究論文，結果表明，Rebecsinib可以抑制ADAR1p150驅動的白血病干細胞自我更新，同時保留正常造血干細胞。同時，Rebecsinib的pre-IND（Investigational New Drug）研究，顯示了良好的毒代動力學和藥效學特征。

  

  一、研究背景

  首先，來給大家介紹一下，Rebecsinib是啥？

  Rebecsinib是一種通過剪接介導的、可活化ADAR1的選擇性小分子抑制劑，它可以抑制白血病干細胞（LSC）的自我更新。在保留正常造血干細胞和祖細胞（HSPC）的劑量下，Rebecsinib可以延長人源化白血病干細胞小鼠模型的存活期。

  然而，預測和預防ADAR1p150介導的惡性RNA編輯是一項重大挑戰。鑒于此，研究人員開發了慢病毒ADAR1和剪接報告子，用于無創檢測剪接介導的ADAR1腺苷到肌苷（A-to-I）的RNA編輯激活。

  二、研究方法

  1、樣本、全轉錄組RNA測序、RNA編輯和剪接異構體分析

  首先，采集骨髓增生性腫瘤/急性髓系白血病患者的原始外周血或骨髓樣本，以及非骨髓增生性腫瘤患者的骨髓對照樣本。接著，經FACS純化、依據標準流程處理樣本后，進行全轉錄組RNA測序。具體來說，使用FastQC、STARv2.5.1a aligner、RSEM48 v1.3.0和GENCODEannotation等工具對數據進行處理。

  在Rebecsinib劑量反應試驗中，5或10mg/kg每周給藥一次sAML50261移植小鼠，從脾臟中分離CD34+細胞；10mg/kg每周給藥兩次sAML50261移植小鼠，收集CD34+細胞。用于全轉錄組測序數據的RNA編輯分析。

  2、慢病毒RNA剪接和ADAR1編輯報告

  為了實現實時、活細胞RNA剪接和編輯定量檢測，研究人員設計并測試了慢病毒雙熒光RNA剪接和ADAR1依賴性RNA編輯載體在人類白血病細胞系中的活性。為了評估ADAR1依賴性編輯，構建了慢病毒報告子，通過熒光和/或發光來測量活性。

  如下圖所示：

  

  圖注：合成包含ADAR1敏感終止密碼子的RNA序列，該密碼子在A-to-I編輯后讀取，產生可由T2A切割位點分離的納米熒光素酶和GFP蛋白。（來源：Crews L.,et al.2023）

  3、體外細胞系治療和分析

  對ADAR1激活中慢病毒介導的人ADAR1進行敲除，以及納米luc-GFP報告子和內源性轉錄物的RNA編輯生物標記物研究，研究人員使用靶向ADAR1（shADAR1）或干擾對照（shCtrl）的慢病毒shRNA載體，穩定地轉導人白血病細胞，消除內源性ADAR1表達。

  此外，研究者還使用人野生型或無催化活性（E912A）突變載體來選擇性表達ADAR1p150。通過定量實時PCR評估病毒滴度，并在293T細胞中測試轉導效率。對于細胞系中的ADAR1蛋白異構體和STAT3磷酸化分析，進行了蛋白免疫印跡分析。

  4、基質共培養物和ADAR1報告子測定

  至于納米熒光素酶RNA編輯活性測定，研究者使用ADAR1納米luc-GFP報告子慢病毒，轉導初級高危體外骨髓纖維化樣品中的CD34+選擇細胞48小時，然后在基質共培養物中用DMSO或Rebecsinib處理72小時。通過納米Glo熒光素酶，測定發光報告子活性，將值標準化為細胞活力。

  

  圖注：體外骨髓纖維化（MF）造血祖細胞（HPC）和白血病干細胞存活和自我更新試驗示意圖。（來源：Crews L.,et al.2023）

  5、剪接異構體特異性定量實時PCR

  為了通過定量實時PCR定量分析剪接異構體表達、RNA編輯率和全基因表達，使用RNA裂解緩沖液處理細胞或組織片段，按照制造商方案提取總RNA。通過定量實時PCR定量ADAR1變體和白血病干細胞特異性轉錄物的水平。并對AZIN1轉錄物中的變體進行RNA編輯位點特異性定量實時PCR（RESSqPCR）。

  6、細胞內ADAR1p150和磷酸-STAT3流式細胞術分析

  進行干細胞和祖細胞表面抗體染色的流式細胞術。對于磷流，固定并滲透一部分樣品，然后用APC結合的ADAR1p150抗體和pSTAT3 APC阻斷和染色。使用BD LSR Fortessa和FlowJo軟件分析餾分。

  7、人源化白血病干細胞小鼠模型測定和人正常造血干細胞和祖細胞治療指數研究

  在人源化小鼠模型中，使用了兩位患者的剪接因子突變或未突變的sAML細胞（CD34+），包括sAML50261和sAML2008-5。在體內療效和治療指數研究中，sAML CD34+細胞或正常人臍帶血來源或老年骨髓來源的正常造血干細胞和祖細胞（CD34+）移植到新生Rag2-/-γc-/-小鼠中，或靜脈注射到成年NSG-SGM3小鼠中。

  

  圖注：顯示原發患者白血病干細胞或臍帶血移植小鼠的體內治療和sAML系列移植研究的示意圖。（來源：Crews L.,et al.2023）

  使用治療動物和對照動物的骨髓和/或脾臟的CD34+細胞，進行Rebecsinib治療后的系列移植測定，包括植入研究和總生存率測定。在另一組動物中，采用Fedratinib治療小鼠兩周（每天兩次，口服60 mg/kg），作為ADAR1表達和活性調節的陽性對照。

  8、臨床前毒代動力學（TK）、藥代動力學和藥效學（PD）研究

  對Sprague-Dawley大鼠、新西蘭白兔和食蟹猴（BASi/Inotiv）進行單劑量TK研究。對于非人靈長類動物（NHP）研究，在給藥雷貝西尼之前和之后，進行健康和眼科評估，并收集血液樣本，量化治療動物和對照動物的血漿雷貝西單抗水平，和PBMC中的生物標志物研究。根據CRO批準的方案計算毒代動力學值，包括平均血漿濃度和t1/2值。

  三、研究結果

  研究人員通過ADAR1剪接異構體轉換的轉錄組學檢測，觀察到標準ADAR1p150剪接亞型ADAR-202，和替代ADAR1p1150亞型ADAR-208的表達增加。研究人員構建了用于非侵入性檢測A-to-I RNA編輯的實時慢病毒ADAR1報告子，且驗證了特異性和靈敏度，能夠檢測到ADAR1p150的激活。

  研究人員發現，抑制ADAR1p150的激活，可防止高風險的MFHPC和白血病干細胞，而Rebecsinib可以抑制ADAR1p150驅動的白血病干細胞自我更新，同時保留正常造血干細胞。Rebecsinib的PK、TK和PD臨床前研究，顯示出化學可擴展性和良好的藥代動力學特征。

  四、總結

  綜上所述，這些結果為開發Rebecsinib作為臨床ADAR1p150拮抗劑奠定了基礎，該抑制劑旨在消除高危MF和sAML患者中，白血病干細胞驅動的治療耐藥性和復發，并可能用于其他因ADAR1介導的免疫沉默，抵抗免疫檢查點阻斷的惡性腫瘤。

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